植物體內(nèi)的碳素營(yíng)養(yǎng)狀況以及農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)性狀，常以糖含量作為重要指標(biāo)。植物為了適應(yīng)逆境條件，如干旱、低濕，也會(huì)主動(dòng)積累一些可溶性糖、降低滲透勢(shì)和冰點(diǎn)，以適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)幾種定量測(cè)定植物體內(nèi)糖含量的方法。
1.慈酮比色法測(cè)定可溶性糖
一、原理
(資料圖片)
糖（sugar）在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糖醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。
糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)，在可見光區(qū)的吸收峰為630 nm，可在此波長(zhǎng)下進(jìn)行比色。
該法的特點(diǎn)是幾乎可以測(cè)定所有的碳水化合物，不但可以測(cè)定戊糖與己糖，而且可以測(cè)寡糖類和多糖類，其中包括蔗糖、淀粉、纖維素等（因?yàn)榉磻?yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)），所以用蒽酮法測(cè)出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測(cè)出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價(jià)值。但在測(cè)定水溶性碳水化合物時(shí)，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘?jiān)尤敕磻?yīng)液中，不然會(huì)因?yàn)榧?xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測(cè)定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測(cè)定糖的混合物時(shí)，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測(cè)定單一糖類時(shí)，則可避免此種誤差。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料
新鮮或烘干的植物葉片。
（二）儀器設(shè)備
分光光度計(jì)，水浴鍋，刻度試管，刻度吸管。
（三）試劑
（1）慈酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，在黑暗中可保存數(shù)星期，如有結(jié)晶析出，可微熱溶解。
（2）濃硫酸（比重1.84）。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
1.1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液
將分析純蔗糖在80℃下烘至恒重，精確稱取1.000 g。加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。
2.100μg/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液
精確吸收1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度試管11支，從0~10分別編號(hào)，按表2-32-1加入溶液和水。
然后按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管均準(zhǔn)確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。
（二）可溶性糖的提取
取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10~0.30g，共3份，或干材料。分別放入3支刻度試管中，加入5～10mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)?，定容至刻度?/p>
（三）顯色測(cè)定
吸取樣品提取液0.5mL于20mL刻度試管中（重復(fù)三次），加蒸餾水1.5mL，以下步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定相同，測(cè)定樣品的吸光度，計(jì)算可溶性糖的含量。
四、結(jié)果計(jì)算
11.?3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖
12.?
一、原理
3，5-二硝基水楊酸溶液與還原糖（各種單糖和麥芽糖）溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色物的顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系。在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定棕紅色物質(zhì)的吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可求出樣品中還原糖的含量。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料食用面粉。
（二）儀器設(shè)備
離心機(jī)，電子天平，分光光度計(jì)，刻度試管，大離心管或玻璃漏斗，燒杯，三角瓶，容量瓶，刻度吸管，沸水浴。
（三）試劑
（1）1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100ml的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
（2）3，5-二硝基水楊酸試劑：6.3g3，5-二硝基水楊酸和262mL2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸佩水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
取7支具有25mL刻度的血糖管或刻度試管，編號(hào)，按表2-32-2所示的量，精確加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3，5-二硝基水楊酸試劑。
將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25mL刻度處，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻（如用大試管，則向每管加入21.5mL蒸餾水，混勻）。在540nm波長(zhǎng)下，用0號(hào)管調(diào)零，分別讀取1~6號(hào)管的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。
2.樣品中還原糖的測(cè)定
（1）樣品中還原糖的提取：準(zhǔn)確稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中，先以少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加50mL蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。離心或過濾，用20mL蒸餾水洗殘?jiān)?，再離心或過濾，將兩次離心的上清液或?yàn)V液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測(cè)液。
（2）顯色和比色：取3支25mL刻度試管，編號(hào)，分別加入還原糖待測(cè)液2mL，3，5-二硝基水楊酸試劑1.5mL，其余操作均與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，測(cè)定各管的吸光度。
四、結(jié)果計(jì)算
分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算還原糖的百分含量：?
Ⅲ.苯酚法測(cè)定可溶性糖
一、原理
植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測(cè)定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛（分子式見蒽酮法）能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10~100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與精的含量成正比，且在485mm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測(cè)定，方法簡(jiǎn)單，試劑便宜、靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色可穩(wěn)定160min以上。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料新鮮的植物葉片。
（二）儀器設(shè)備
分光光度計(jì)，水浴鍋，刻度試管，刻度吸管。
（三）試劑
（1）90%苯酚溶液。稱取90g苯酚（AR），加蒸餾水10mL溶解，在室溫下可保存數(shù)月。
（2）9%苯酚溶液。取3mL90%苯酚溶液，加蒸餾水至30mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。
（3）濃硫酸（比重1.84）。
（4）1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液。將分析純蔗糖在80℃下烘至恒重，精確稱取1.000g，加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。
（5）100 μg/L 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取1%蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL加入100ml.容量瓶中，加水至刻度。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取20mL刻度試管11支，從0~10分別編號(hào)，按表2-32-3加入溶液和水。?
然后按順序向試管內(nèi)加入1mL9%苯酚溶液，搖勻，再?gòu)墓芤赫嬉?~20 s加入5mL濃硫酸，搖勻。比色液總體積為8mL，在室混下放置30min，比色。然后以空白為參比，在 485 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度，以糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
2.可溶性糖的提取
取新鮮植物葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10~0.30g，共3份（或干材料），分別放入3支刻度試管中，加入5～10mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)ㄈ葜量潭取?.測(cè)定
吸取0.5ml樣品液于試管中（重復(fù)2次），加蒸餾水1.5mL，步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液，顯色并測(cè)定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出糖的含量。
四、結(jié)果計(jì)算
IV.斐林試劑比色法測(cè)定還原糖
一、原理
植物組織中的可溶性糖可分為還原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非還原糖（主要是蔗糖）兩類。還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸，能把斐林試劑中的Cu2+還原成Cu+，使藍(lán)色的斐林試劑脫色，脫色的程度與溶液中含糖量成正比，在590 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出所測(cè)樣品中還原糖的含量。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料
新鮮植物樣品或烘干粉碎過的植物樣品。
（二）儀器設(shè)備
分光光度計(jì)，分析天平（感量1/10 000），離心機(jī)，水浴鍋，具塞刻度試管，刻度吸管，容量瓶、研缽。
（三）試劑
（1）斐林試劑A液：40g CuSO4·5H20溶解于蒸餾水定容至1L。
（2）斐林試劑B液：200g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·5H20）與150g NaOH溶于蒸餾水中，并定容至1L。
A、B兩液分別貯存，使用前等體積混合。
（3）0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸餾水溶解，定容至100ml。
（4）0.1N NaOH。
（5）甲基紅指示劑：0.1g甲基紅溶于250ml.60%乙醇中。
（6）(6)10% Pb(Ac)2。
（7）飽和Na2SO4。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取7支試管，按表2-32-4分別加入各溶液。
將以上各管混合后加塞，于沸水浴中加熱15min。取出后自來水冷卻，1500 r/min離心15 min。取上清液，用分光光度計(jì)在590 nm波長(zhǎng)下比色，以蒸餾水作對(duì)照，讀取吸光度。用空白管的吸光度與不同濃度糖的各管的吸光度之差為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的糖含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.樣品中還原糖的提取
取新鮮的植物樣品洗凈、擦干、剪碎，稱取10.00g，放入研缽中研磨至糊狀，用水洗人250ml容量瓶中。當(dāng)體積近150ml左右時(shí)，加2~3滴甲基紅指示劑，如呈紅色，可用0.1 mol/L的NaOH中和至微黃色。若用風(fēng)干樣品，可稱取干粉3.00g，先在燒杯中用少量水濕潤(rùn)，然后用水洗入250mL容量瓶中，如顯酸性，可用上法中和。
將容量瓶置于80℃的恒溫水浴中保溫30min，其間搖動(dòng)數(shù)次，以便將還原糖充分提取出來。對(duì)含蛋白質(zhì)較多的樣品，此間可加10% Pb（Ac）2，除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時(shí)，加飽和Na2SO4，除去多余的鉛離子。30 min后取出冷卻，定容至刻度，搖勻后過濾待測(cè)。
3.樣品測(cè)定
吸取6mL待測(cè)液，加4mL斐林試劑，其他操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，在590 nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度。以不含樣品的空白管的吸光度減去樣品管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出糖含量。
四、結(jié)果計(jì)算
按下式計(jì)算還原糖的百分含量。
關(guān)鍵詞： 標(biāo)準(zhǔn)曲線 硝基水楊酸 斐林試劑
